2020 - 2023 m. Lietuvoje ir pasaulyje siautusi COVID-19 pandemija atnešė daugybę neigiamų pasekmių. Tačiau ši pandemija paskatino tam tikrą mokslo ir tyrimų plėtrą, visų pirma susijusią su SARS-CoV-2 viruso nustatymo ir COVID-19 diagnostikos metodų ir technologijų kūrimu. Pamokos, išmoktos COVID-19 pandemijos metu, yra ir bus ateityje prasmingos ne tik paties SARS-CoV-2 viruso sukeltos infekcijos nustatymui bei COVID-19 pandemijos suvaldymui, bet galėtų būti pritaikytos ir kitų virusinių ligų protrūkių kontrolei.
Molekulių įspaudais modifikuoti polimerai ir jų kūrimas
Molekulių įspaudais modifikuotus polimerus (MIP) vaizdžiai galime palyginti su tam tikro dydžio kairės kojos batu, tinkančiu tik kairei tokio paties dydžio kojai. Susidomėjimas tokių polimerų pritaikymu moksle šiuo metu auga labai sparčiai.
MIP kūrimo principą labai supaprastinus galima apibūdinti keliais etapais: MIP formavimui yra naudojama šabloninė molekulė, kuri atitinka nustatomąją molekulę. Šablono molekulės savo forma ir savybėmis turi sutapti su tomis, kurias atpažįsta joms pritaikytas molekulių įspaudais modifikuotas polimeras. Kitos biologinio atpažinimo sistemos, su kuriomis galime šiek tiek palyginti MIP, yra tokios kaip antigeno-antikūno arba fermento-substrato. MIP gali būti taikomi elektrocheminiuose jutikliuose, skirtuose nustatyti tiek mažos molekulinės masės molekules (pvz. teofiliną, kofeiną, histaminą, šlapimo rūgštį ir t.t.), tiek ir didelės molekulinės masės objektus (pvz., baltymus, DNR, virusus, bakterijas) (Pav. 1a). Ant įvairių elektrodų paviršiaus (grafito elektrodo, platinos elektrodo, aukso elektrodo ir kt.) įvykus mišinyje esančių funkcinių monomerų polimerizacijai cheminiais, elektrocheminiais ir kitais metodais, šabloninės molekulės įsiterpia į susidarantį polimero sluoksnį. Nešiojamiems jutikliams kurti dažnai naudojami šilkografijos metodu pagaminti vienkartiniai elektrodai. Analizuojamą molekulę išplovus iš nusodinto polimero sluoksnio lieka tuščios ertmės arba įspaudai, turintys tokią pačią molekulės erdvinę formą ir struktūrą (Pav. 1b). Atliekant tiriamo mėginio analizę, analizinis signalas gaunamas tik kai mėginyje yra atitinkamų analitės molekulių, atitinkančių įspaudų formą (Pav. 1c) [G. Pilvenyte, V. Ratautaite, R. Boguzaite, S. Ramanavicius, C.-F. Chen, R. Viter, A. Ramanavicius, Molecularly Imprinted Polymer-Based Electrochemical Sensors for the Diagnosis of Infectious Diseases, Biosensors 13(6) (2023) 620, https://doi.org/10.3390/bios13060620.].
Pav. 1. Molekulių įspaudais modifikuotų polimerų paruošimo schema: a) į polimerus galima įspausti tiek mažos molekulinės masės molekules, tiek didelius molekulinius junginius – RNR, DNR, baltymus, virusus, bakterijas arba ląsteles; b) molekulių įspaudų polimere paruošimo schema: paruošiamas monomero ir analitės mišinys, jis polimerizuojamas, po to analitė iš susidariusio polimero sluoksnio išplaunama, lieka jos įspaudai; c) mėginio tyrimas: mėginyje esančios ieškomos analitės molekulės įsijungia į polimero ertmes dėl atitinkančios erdvinės formos. Kitokios struktūros molekulės su polimeru taip stipriai nesąveikauja ir polimero fizikinės charakteristikos nesikeičia, todėl analizinio signalo pokytis neregistruojamas. Paveikslas sukurtas naudojant Biorender.com
Elektrocheminiai metodai MIP paruošimui
Ypač ploniems MIP sluoksniams ant elektrodo gauti geriausiai yra tinkami elektrocheminiai polimerizacijos metodai. Tai gali būti ciklinis arba impulsinis elektros potencialo keitimas. Šie metodai patogūs naudoti, kadangi įgalina valdyti įvairius elektrocheminius parametrus, dėl kurių polimero sluoksnio storis, porėtumas ir kitos charakteristikos yra lengvai kontroliuojamos. Pašalinus šablono molekulę, suformuojamos molekulės struktūrą atitinkančios ertmės, į kurias mėginio analizės metu įsiterpia nustatomos analitės molekulės. Analizinio signalo nustatymas atliekamas taikant elektrocheminius analizės metodus. Metodų pasirinkimas apsprendžia jutiklio jautrumą, pvz., taikant diferencinę impulsinę voltamperometriją MIP grįstais jutikliais pavyksta aptikti itin mažas SARS-CoV-2 viruso koncentracijas, nes šis metodas pasižymi didesniu jautriu, lyginant su kitais metodais. Tai iliustruoja, kad teisingai pasirinkti elektrocheminės analizės metodai gali turėti įtakos jutiklių efektyvumui.
Įspaudžiamų molekulių tipai
Vienas didžiausių MIP privalumų yra jų universalumas. Jie gali būti sukurti taip, kad įspaustų įvairias molekules bei įvairias virusų dalis, įskaitant juos sudarančius baltymus, DNR arba RNR fragmentus ar netgi visą virusą. Įspaudžiant į polimerą tik viruso dalį, pvz., viruso baltymus, tokius kaip smaigalio baltymas, galima identifikuoti ir visą virusą. SARS-CoV-2 viruso atveju, buvo sukurti MIP pagrįsti jutikliai, įspaudžiant tokius skirtingus SARS-CoV-2 baltymus kaip nukleokapsidės baltymas, smaigalio baltymas, smaigalio baltymo 1 subvienetas, smaigalio baltymo epitopas, taip pat visas virusas, pseudo-dalelės (replikacijos neatliekantys lentivirusai, įspausti SARS-CoV-2 viruso smaigalio baltymu). Nors formuojant MIP galima įspausti įvairaus dydžio molekules, reikia atsižvelgti ir į kuriamo jutiklio taikymo ypatybes. Jutiklių su epitopo (antigeno dalimi, sudaryta iš kelių aminorūgščių) įspaudais gamyba gali būti pigesnė, nes juos galima sintetinti dideliais kiekiais cheminės sintezės būdu. Didesnių objektų – tokių kaip nepažeistas virusas arba jo baltymai – kaina yra didesnė. Taip pat epitopais įspaudus polimerus gali padidėti sistemos, skirtos viso baltymo nustatymui, jautrumas. Nors į MIP galima įspausti įvairaus dydžio molekules, tačiau reikia racionaliai pasirinkti, kurios šabloninės molekulės yra tinkamiausios siekiant nustatyti tikslinę analitę.
SARS-CoV-2 viruso nustatymo ir COVID-19 diagnostikos metodai
Nuo pat pandemijos pradžios buvo taikomi įvairūs diagnostikos metodai, skirti COVID-19 infekcijos nustatymui. Pažymėtina, kad kiekvienas diagnostikos metodas turi tam tikrų privalumų bei trūkumų, todėl juos nuolat reikia tobulinti.
Virusinės infekcijos nustatymui naudojami du pagrindiniai būdai: specifinio organizmo atsako į virusą arba paties viruso sudėtinių dalių nustatymo. Antikūnų atsakui įvertinti naudojami serologiniai metodai, o viruso buvimą galima įrodyti specifinių antigenų arba genų sekų (molekuliniai) nustatymo metodais (Pav. 2). Serologiniai kraujo tyrimai yra naudojami nustatyti, ar žmogaus organizme susidarė pakankama specifinių antikūnų koncentracija prieš infekcijos agentą po vakcinacijos arba po persirgimo infekcine liga. Įvertinant skirtingų specifinių antikūnų koncentracijas taip pat galima nustatyti ligos sunkumą ir jos stadijas. Priklausomai nuo infekcijos sukėlėjo, antikūnai gali išlikti kraujyje mėnesius ar net visą gyvenimą. Tačiau naujagimių infekcijų atveju dėl motinos antikūnų gali būti neįmanoma įvertinti kūdikio imuninės sistemos atsako. Pacientų, kurių imunitetas susilpnėjęs, imuninis atsakas dažnai yra per silpnas, kad būtų galima jį įvertinti. Tokiais atvejais reikėtų naudoti specifinius diagnostikos metodus.
Gana dažnai yra naudojamas molekulinio tyrimo metodas, kuris yra labai specifiškas ir jautrus, jį gali atlikti tik specialiai apmokytas personalas, taip pat reikalinga specializuota ir gana brangi laboratorinė įranga. Todėl labai dažnai naudojamas antigenų (viruso struktūrinių baltymų) nustatymas. Šiuo tyrimu galima identifikuoti aktyvios virusinės infekcijos agento buvimą organizme, tačiau šis metodas yra mažiau jautrus už molekulinį tyrimą. Ankstyvose infekcijos stadijose analizinės sistemos atsakas gali būti neigiamas dėl per mažos virusų koncentracijos. Dėl šio metodo mažesnio jautrumo labai svarbu, kad rezultatai būtų patvirtinami molekuliniu tyrimu. Vienas dažniausiai naudojamų metodų antigenų nustatymui yra „šoninio srauto tyrimas“. Šis tyrimas apima mėginio užnešimą į tam skirtą jutiklio zoną, pvz., celiuliozės juostelės, kur, tirpalui su nustatomais antigenais sklindant, pasiekiama ta juostelės vieta, kurioje yra chemiškai imobilizuoti antigenus prijungiantys receptoriai. Specifiškai receptorių atpažįstami antigenai prisijungia prie įmobilizuotų receptorių, o kitos su receptoriais nereaguojančios medžiagos juda toliau su tirpalu. Sistema suformuota taip, kad tose vietose, kur prisijungia nustatomi antigenai, išryškėja „teigiamo rezultato“ ir „kontrolinė“ juostelės. Nors COVID-19 pandemijos metu tokie šoninio srauto testai buvo itin dažnai naudojami ne tik sveikatos priežiūros įstaigose, jų jautrumas vis dar yra mažesnis nei etaloninių AT-PGR metodų.
COVID-19 diagnostikai taip pat yra naudojami ir vaizdiniai tyrimai, tokie kaip krūtinės ląstos kompiuterinė tomografija. Šis metodas įgalina diagnozuoti tikslius organų ir audinių pažeidimus, todėl galima tiksliau numatyti ligos eigą arba komplikacijų lygį persirgus COVID-19, net kai pacientams nepasireiškia tipiniai simptomai. Tačiau šio tyrimo naudą riboja tai, kad jis kelia didelę apšvitinimo jonizuojančia spinduliuote riziką (1000 kartų stipresnė nei rentgeno spinduliai), ypač jei jis yra dažnai kartojamas. Be to, kompiuterinė tomografija yra mažai specifinis tyrimas, ir yra ypač neefektyvus ne epideminiuose regionuose, kadangi tyrimui yra reikalinga brangi stacionari įranga bei apmokytas personalas.
Apibendrinant galima teigti, kad įprasti molekuliniai ir serologiniai metodai turi tam tikrų apribojimų. Molekulinio metodo atveju reikalingas ilgas mėginio apdorojimo laikas, šis metodas daug sudėtingesnis ir atliekamas gana brangiuose įrenginiuose, jį gali realizuoti tik gerai apmokyti darbuotojai. Tuo tarpu serologiniai tyrimai yra mažiau jautrūs bei jais negalima įvertinti, ar nustatymo metu infekcija dar yra aktyvi, o kiekvieno paciento imuninio atsako savybės padidina klaidingų tyrimo rezultatų tikimybę.
Pav. 2. Išskiriami trys svarbesni COVID-19 diagnostikos metodai: antikūnų atsako į virusą įvertinimas, molekulinis tyrimas, aptinkant specifinę SARS-CoV-2 RNR seką, ir antigenų (pilno viruso arba jo struktūrinių baltymų) nustatymas (Paveikslas iš: M. Drobysh, A. Ramanaviciene, R. Viter, A. Ramanavicius, Affinity Sensors for the Diagnosis of COVID-19, Micromachines 12(4) (2021) 390, https://doi.org/10.3390/mi12040390).
Biologiniai jutikliai dažnai yra ekonomiški, modernūs, nešiojami ir jautrūs palyginus su daugeliu anksčiau aprašytų diagnostikos metodų. Tokie jutikliai gali būti naudojami ir SARS-CoV-2 infekcijai nustatyti. Jutikliai – tai prietaisai, sudaryti iš tikslinės molekulės atpažinimo elemento (receptoriaus), signalo keitiklio ir elektroninės sistemos. Keitiklis užfiksuoja kontaktą su analite ir greitai nustato ją dideliu tikslumu. Jutiklių tipai yra skirstomi pagal tai, kokiu būdu yra registruojamas analizinis signalas, dažniausiai yra taikomi optiniai, elektrocheminiai [https://doi.org/10.1016/j.electacta.2021.139581] ar mikrosvarstyklių analizinio signalo nustatymo būdai [G. Pilvenyte, V. Ratautaite, R. Boguzaite, U. Samukaite-Bubniene, D. Plausinaitis, A. Ramanaviciene, M. Bechelany, A. Ramanavicius, Molecularly imprinted polymers for the recognition of biomarkers of certain neurodegenerative diseases, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 228 (2023) 115343, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2023.115343].
Taigi į MIP galima įspausti įvairaus dydžio molekules, tačiau reikia racionaliai pasirinkti, kurios šabloninės molekulės yra tinkamiausios siekiant nustatyti tikslinę analitę.
Molekulių įspaudais modifikuotų polimerų rūšys ir modifikacijos
Naudojat elektrocheminę MIP polimerizaciją galima ant elektrodų paviršių suformuoti plonas įvairių elektrai laidžių ir nelaidžių polimerų plėveles, kontroliuojant jų storį bei pralaidumą. Elektrai laidžių polimerų, tokių kaip polianilinas arba polipirolas, struktūros pagrindą sudaro π-konjuguotos grandinės, kurios įgalina grandine judėti krūvininkus ir suteikia polimerui elektrinį laidumą. Vykdydama bendrą Lietuvos, Latvijos ir Taivano projektą „Flow-through System Based Immunoanalytical Devices for the Diagnosis of Viral-infections“ Nr. S-LLT-21-3 ir bendradarbiaudama su Latvijos ir Taivano mokslininkais, VU ir FTMC mokslinių grupių mokslininkai šiuo metu kuria elektrocheminius biologinius jutiklius, skirtus antikūnams prieš SARS-CoV-2 virusą aptikti. Šiuose jutikliuose tikimasi pritaikyti ir molekulių įspaudais modifikuotus elektrai laidžius polimerus.
Tinkamo polimero pasirinkimui galima pasitelkti kompiuterinio modeliavimo metodus, kuriuos tikslinga atlikti prieš pradedant eksperimentus ir sistemingai atmetant netinkamus variantus. Tokiu atveju galima sutaupyti laiko ir resursų. Pritaikius kompiuterinio modeliavimo metodu parinktą poli-m-fenilendiamino polimerą SARS-CoV-2 nukleo-kapsidės baltymui nustatyti buvo gautas itin jautrus MIP grįstas elektrocheminis jutiklis. Mėginiuose, paimtuose iš COVID-19 užsikrėtusių pacientų nosiaryklės tepinėlių aptikimo riba siekia 15fM ir jutiklis atrankiai aptinka būtent ieškomą nukleokapsidės baltymą, nepaisant mėginyje esančių kitų panašių molekulių.
Tam pačiam SARS-CoV-2 nukleokapsidės baltymui aptikti pasirinkus kitą polimerą – laidų poliargininą bei papildomai elektrodą modifikuojant aukso nanodalelėmis ir grafenu, buvo suformuotas kitas MIP grįstas jutiklis. Poliargininas įspaudams buvo pasirinktas dėl didelio elektrinio laidumo ir gero stabilumo, o aukso nanodalelės ir grafenas – siekiant padidinti aktyvųjį paviršiaus plotą, taip sudarant daugiau sąryšio vietų, tinkamų sąveikai su tuo pačiu SARS-CoV-2 nukleokapsidės baltymu.
Pažymėtina, kad kartais pasirinktas polimeras gali padidinti sistemos atrankumą netgi sudarydamas kovalentinius ryšius su įspausta molekule. Kadangi SARS-CoV-2 viruso paviršiuje esantis smaigalio baltymas yra glikoproteinas, tai reiškia, kad jame yra ir angliavandenių, kurie gali lengvai reaguoti su pasirinkto polimero tam tikrais atomais. Taip padidinamas jutiklio giminingumas virusui leidžia atrankiai aptikti ieškomą tikslinę molekulę.
Pasirinkus polipirolo-boro rūgšties polimerą buvo sukurtas jutiklis, aptikti visą SARS-CoV-2 virusą [https://doi.org/10.1002/admi.202101466]. Toks jutiklis buvo itin atrankus SARS-CoV-2 virusui dėl jo dizaino – pasirinktas polipirolo-boro rūgšties polimeras bei grafeno struktūros, kurios padidina aktyvųjį paviršiaus plotą, elektrinį laidumą ir jutiklio jautrumą. Itin žema aptikimo riba bei santykinai ilgas jutiklio stabilumo laikas įrodo tokių jutiklių taikymo perspektyvumą.
Aptariamuose tyrimuose pateikiami rezultatai rodo, kad MIP grįsti elektrocheminiai jutikliai gali būti naudojami kaip diagnostikos priemonė SARS-CoV-2 infekcijos biožymenims nustatyti. MIP grįstų jutiklių efektyvumas yra tiesiogiai susijęs su jutiklio struktūra: šabloninių molekulių ir polimero pasirinkimu, modifikavimu, bei elektrocheminio analizinio metodo pasirinkimu. Taip pat suderinimas su miniatiūriniais potenciostatais yra puikus pavyzdys, kaip ateityje elektrocheminiais MIP grįsti jutikliai galėtų būti naudojami už laboratorijos ribų. COVID-19 pandemijai palietus visą pasaulį, supratome masinei analizei skirtų diagnostikos prietaisų svarbą ir poreikį. Vienas iš diagnostikos įrenginių paklausos problemos sprendimų galėtų būti sietinas su molekulių įspaudais modifikuotais polimerais grįstų jutiklių kūrimu.
Dokt. Greta Pilvenytė, dr. Vilma Ratautaitė, doc. Urtė Prentice, prof. Arūnas Ramanavičius